Hücre içermeyen ekspresyon için E.coli lizatlarına dayanan nanodisklerle izole edilen A streptomyces A, Ion Channel, hücresiz protein KcsA, potasyum kanalı K kanalı sunuyoruz.

HÜCRESİZ proteinimizİşlev doğrulandı.

Giriş

KCSA (Streptomyces A'nın K kanalı) toprak bakterilerinden prokaryotik bir potasyum kanalıdır Streptomyces lividansİyon kanalı araştırmalarında yoğun olarak incelenmiştir.PH ile aktive edilen protein, iki zar ötesi segmente ve K'nin kapısından ve kepenklenmesinden sorumlu olan oldukça seçici bir gözenek bölgesine sahiptir.⁺iyonlar hücre dışına çıkar.KcsA'nın seçicilik filtresinde bulunan amino asit sekansı, hem prokaryotik hem de ökaryotik K arasında oldukça korunmuştur⁺voltaj kanalları;Sonuç olarak, KcsA üzerine yapılan araştırmalar, K için moleküler bazda önemli yapısal ve mekanik bilgiler sağlamıştır.⁺iyon seçimi ve iletimi.Bu güne kadar en çok çalışılan iyon kanallarından biri olan KcsA, K ​​ile ilgili bir araştırma şablonu⁺ kanal fonksiyonu ve aydınlatılmış yapısı, hem prokaryotik hem de ökaryotik türler için kanal dinamiklerinin hesaplamalı modellenmesinin temelini oluşturur.

fonksiyon

KcsA kanalı bir model kanalı olarak kabul edilir, çünkü KcsA yapısı K'yi anlamak için bir çerçeve sağlar⁺üç bölümden oluşan kanal iletimi: Potasyum seçiciliği, pH duyarlılığı ile kanal geçişi ve voltaj geçişli kanal inaktivasyonu.K⁺iyon geçirgenliği, gözeneğin üst seçicilik filtresi bölgesinde meydana gelirken, pH kaplaması, gözeneğin sonundaki transmembran helislerin protonasyonundan yükselir.Düşük pH'ta, M2 sarmalı protonlanır, iyon kanalı kapalıdan açık konformasyona kaydırılır.İyonlar kanaldan aktıkça, voltaj kapama mekanizmalarının, iletkenlik uyumunu dengesizleştiren ve voltajın C-tipini inaktivasyonuna benzeyen uzun ömürlü, iletken olmayan bir duruma girmeyi kolaylaştıran, seçicilik filtresinde Glu71 ve Asp80 arasındaki etkileşimleri indüklediği düşünülmektedir. bağımlı kanallar.

PH 7'de KcsA'nın iletken olmayan konformasyonunda, K⁺seçicilik filtresinin oksijeni koordine etmeye sıkıca bağlıdır ve dört TM2 helis sitoplazmik bileşimin yakınında herhangi bir potasyum iyonunun geçişini bloke etmek üzere yakınsar.Bununla birlikte pH 4'te, KcsA milisaniye-zaman ölçeğine uygun değişim borsalarına nüfuz eden ve geçirmeyen durumları ve M2 helislerinin açık ve kapalı konformasyonları arasında filtre uygular.Bu belirgin konformasyonel değişiklikler kanalın ayrı bölgelerinde meydana gelirken, her bölgenin moleküler davranışı hem elektrostatik etkileşimler hem de allostery ile bağlantılıdır.Filtredeki bu değişim stereokimyasal konfigürasyonlarının dinamikleri, eşzamanlı K için fiziksel temeli sağlar⁺ iletkenlik ve geçitleme.

Yapıları

Bakteriyel kristal yapının (0.32 nm) ortaya çıkmasıyla (Streptomyces lividans) İyon kanalı yapısı için kilit taşı olan potasyum kanalı KcsA verilmiştir.Topolojisinin iç ve dış sarmal ile bitopik olduğu belirlenmiştir.İki helis “gözenek sarmalı” ve seçicilik filtresi ile bağlanır.Dört alt birim, iyonların iki tabakayı geçmesi için bir yol çizerek kanalı oluşturur.Bir iyonun geçişi sitoplazmik taraftaki bir kapıyı geçmek ve iç sarmalın dipol momenti yoluyla iyonu stabilize eden bir giriş holü içine hareket etmek olarak tanımlanabilir.İyonların, seçicilik diskini, zaten filtre içinde bulunan potasyum iyonları ile uyumlu bir hareketle geçirmeleri gerekir.Yüksek seçiciliğiyle KcsA, voltaj geçişli K kanallarıyla (Kv) iyon geçirgenliği bakımından benzerlik ve topolojide içe doğru düzeltici K kanallarıyla benzerlik gösterir.Dikkat edilmesi gereken önemli olan, KcsA kanallarının pH değişiklikleri ile tetiklenmesidir.Potasyum için K kanallarının sodyum üzerinde muazzam seçiciliğinin nedeninin deşifre edilmesi bugüne kadar bir zorluktur.KcsA'nın yapısının kapalı bir aşamayı temsil etmesi beklenmektedir.Bir prokaryotik (0.33 nm) yapısı ileMethanobacterium thermoautotrophicum).Aktivasyon sırasında, iç sarmallar radyal dışa doğru iter ve sitoplazmik taraftaki daralmayı açar.Bu açıklığa 99. pozisyonda (G99) bir glisin kalıntısı etrafındaki bir menteşe eşlik eder.Bu, iyon kanalları için şimdiye kadar açıklanan en belirgin konformasyonel değişikliktir.Seçicilik filtresi yapısal konumunda değişmeden kalır ve dış sarmal sadece marjinal konformasyonel değişikliklere uğrar.Bu derlemenin bağlamı ve Vpu'nun KcsA ile ilgili bulgularına ilişkin bir sonuç olarak.

E.Coli sisteminin avantajı

1. Yüksek protein verimi
2. Basit yetiştirme ve hızlı hücre büyümesi ve lizat hazırlama
3. Maliyet açısından verimli
4. Kolay genetik mühendisliği
5. Köklü