QC Raporu Ökaryotik Proteinler Proteinleri Birleştiriyor Memeli İfade Sistemi

Giriş

Memeli hücreleri, proteinlerin sentezi, işlenmesi ve salgılanması dahil olmak üzere ökaryotik proteinleri doğru ve etkili bir şekilde eksprese edebilir.Memeli sistemi, proteinlerin translasyon sonrası modifikasyonunun mükemmel fonksiyonuna sahiptir ve proteinleri doğru şekilde birleştirebilir.Bunun nedeni, memeli sistemlerinin endoplazmik retikulum, Golgi aygıtı ve hücre naklinde ve translasyon sonrası modifikasyonda anahtar element olan diğer organellere sahip olmasıdır.

Çeviri sonrası değişikliklerin çoğu çeviri sırasında veya kısa bir süre sonra gerçekleşir.Atılan proteinler, uygun katlanmayı, disülfür bağını ve N-bağlı glikosilasyonu kolaylaştıran enzimlerin bulunduğu endoplazmik retikulumda yapılır.Ek olarak, atılmadan önce, bir protein, O-bağlı glikosilasyonun da meydana gelebileceği golgi aparatından geçecektir.Tüm bu modifikasyonlar, antikorlar dahil olmak üzere memeli hücreleri tarafından eksprese edilen birçok proteinde meydana gelir.

Memeli hücrelerinin protein ekspresyonu için iki yol vardır: geçici transfeksiyon ve stabil transfeksiyon.Geçici transfeksiyonda HEK293 veya CHO hücreleri sıklıkla kullanılır.Geçici transfeksiyondan sonraki bir hafta içinde az miktarda protein hızlı bir şekilde elde edilebilir.Bu arada, stabil transfeksiyon ve taramadan sonra hücre çizgileri üretmek için kullanılabilen, stabil şekilde transfekte edilebilen düzinelerce hücre vardır.Kararlı hücre çizgileri, hedef genin ekspresyon seviyesinde önemli bir değişiklik olmadan uzun bir süre boyunca sürekli olarak büyüyebilir.

Deneysel Süreç

1. Müşteriler tarafından sağlanan gen sekanslarının analizi: kodon optimizasyonu, protein transmembran yapısı, hidrofobiklik, sekretuar protein olsun ya da olmasın.
2. Gen sentezi ve plazmid yapısı: hedef gen, çift enzim sindirimi yöntemiyle CELLFREE'nin tescilli vektörüne bağlanır ve doğruluğu enzim sindirimi ve dizilemesi ile test edilir.
3. Plazmid transformasyonu ve max-hazırlığı: plazmid transformasyonu yetkin hücreleri ve transfekte plazmid max-preparasyonu.
4. Hücre transfeksiyonu: memeli hücresi için ekspresyon transfeksiyonu yöntemi geçici transfeksiyon ve stabil transfeksiyon ifadeleridir.
5. Hücre kültürü ve protein ekspresyonu.
6. Protein saflaştırma ve QC

Geçici VS.Kararlı Transfeksiyon

Geçici Transfeksiyon

1. Klonlanmış genleri 3-7 gün içinde hızlı bir şekilde büyük miktarlarda proteine ​​dönüştürün.

2. Tamamen translasyon sonrası modifiye edilmiş ve aktif memeli proteini edinin.

3. Salgılanan proteini serumsuz hücre kültürü ortamından kolayca arındırın.

4. 50 çok oyuklu plakadan 25L ve daha fazla kültür hacmini genişletin

Kararlı Transfeksiyon

1. Araştırma deneyi: transmembran, iyon kanalları, enzimler, GPCR'ler ve diğerleri
2. Hücre bazlı analiz ve diğer fonksiyonel çalışmalar
3. Rekombinant protein / antikor üretimi (endüstriyel)