GST Aşağı Çekin Protein Etkileşimi Kompleks Protein Ekspresyonu ve Saflaştırılması

Aşağı açılan testlere giriş

Aşağı açılan test bir laboratuvar ortamındaiki veya daha fazla protein arasındaki fiziksel etkileşimi belirlemek için kullanılan yöntem.Aşağı çekme deneyleri, hem diğer araştırma teknikleri (örn., Ko-immüno-çökeltme) tarafından öngörülen bir protein-protein etkileşiminin varlığını doğrulamak için hem de daha önce bilinmeyen protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için bir ilk tarama deneyi olarak yararlıdır.

Aşağı çekme deneyleri bir afinite saflaştırma formudur ve bir antikor yerine bir "yem" proteininin kullanılması dışında immüno-çökeltmeye benzerdir.Afinite kromatografisi (yani afinite saflaştırma) metodolojileri, protein saflaştırmanın hızını ve verimliliğini büyük ölçüde arttırır ve aynı zamanda potansiyel bağlanma ortaklarının aşağı çekilmesini veya birlikte saflaştırılmasını gerçekleştirmek için teknoloji platformunu sağlar.Bir aşağı çekme tahlilinde, bir yem proteini etiketlenir ve etikete özgü hareketsizleştirilmiş bir afinite ligandı üzerinde yakalanır, böylece yem proteini ile etkileşime giren diğer proteinleri saflaştırmak için bir "ikincil afinite desteği" oluşturulur.İmmobilize edilmiş yemin ikincil afinite desteği daha sonra bir hücre lizatı gibi varsayılan "av" proteinleri içeren bir protein kaynağı ile inkübe edilir.Bu adımdaki av proteinin kaynağı, araştırmacının daha önce şüphelenilen bir protein-protein etkileşimini doğrulayıp onaylamadığına veya bilinmeyen bir etkileşimi belirleyip belirlemediğine bağlıdır.Protein elüsyon yöntemi, afinite ligandına bağlıdır ve rekabetçi analitlerin kullanılmasından düşük pH'ya veya indirgeyici tamponlara kadar değişir.

İki veya daha fazla proteinin etkileşimini araştırmanın yanı sıra, aşağı çekme deneyleri spesifik proteinlerin aktivasyon durumunu tespit etmek için güçlü bir araçtır.Örneğin, tirozin fosforilasyonuna yanıt olarak aktive edilen proteinler, belirli bir protein üzerindeki fosforile tirozini hedefleyen hareketsizleştirilmiş bir SH2 alanı kullanılarak aşağı çekilebilir.Ek olarak, bir GTP'ye bağlı (aktif) ve GDP'ye bağlı (aktif olmayan) durum arasında döngü yaparak hücre sinyallemesini düzenleyen moleküler anahtarlar olarak hareket eden GTPazlar, işe alınan alt proteinlerin hareketsizleştirilmiş bir GTPaz bağlayıcı alanı kullanılarak aşağı çekilebilir GTP'ye bağlı, etkinleştirilmiş GTP tabanları.Her iki aşağı çekme tahlilinde de, etkileşimin özgüllüğü bağlanma alanının dizisine bağlı olduğundan, bu yaklaşımlar farklı proteinlerin aktivasyonunun saptanmasında oldukça spesifiktir.

Protein komplekslerinin alınması için farklı aşağı çekme deneyleri ile avantaj ve dezavantajlar