40 kDa Alfa Hemolizin Bakteri Toksin E.Coli Lizat Hücre İçermeyen Protein

Firmamız hücresiz ekspresyon için E.coli lizatlarına dayanan nanodisklerle izole edilen Alfa hemolizin, Bakteri toksini, hücresiz protein sunmaktadır. HÜCRESİZ proteinİşlev doğrulandı.

Giriş

Kaynaklarla mücadelesinde, bakteri Staphylococcus aureusduyarlı hücrelerin dış zarına bağlanan alfa-hemolizin monomerlerini salgılar.Bağlandığında, monomerler oligomerize ederek su, iyonlar ve küçük organik moleküllerin kontrolsüz nüfuz etmesini kolaylaştıran, su ile doldurulmuş bir transmembran kanalı oluştururlar.ATP gibi hayati moleküllerin hızlı deşarjı, membran potansiyeli ve iyonik gradyanların dağıtılması ve hücre duvarı rüptürüne (lizis) yol açan geri dönüşümsüz ozmotik şişme konakçı hücrenin ölümüne neden olabilir.Bu gözenek oluşturucu özellik, protein toksinlerinin hücrelere zarar verebileceği ana mekanizma olarak tanımlanmıştır.Alfa-hemolizin adı, kırmızı kan hücreleri üzerinde toksinin litik aktivitesini kuran erken gözlemlerden kaynaklanır.Şimdi, yeterli dozda uygulandığında alfa-hemolizinin herhangi bir memeli hücre zarına nüfuz edebileceği beklenmektedir.İnsan popülasyonunun çoğu için alfa-hemolizin salgılanması ciddi bir sağlık riski oluşturmasa da, ciddi stafilokok enfeksiyonu neden olabilirhemostazbozuklukları, trombositopeni, ve akciğer lezyonlar .
Kristalografik yapı Birleştirilen alfa-hemolizin, kanalın heptametrik bir organizasyonunu ortaya çıkardı.Protein mantar benzeri bir şekle sahiptir, kapak alanından lipit çift katmanından hücrenin içine doğru çıkıntı yapan 50A beta-varil sapı vardır.Proteinin kapağı, kapağın üstündeki büyük bir açıklık vasıtasıyla hücrenin dışına bağlanan büyük bir giriş kapağını gizler.Kanalın en dar (1.4 ~ nm çapında) kısmı, beta-namlu gözeneğinin giriş holü ile birleştiği sapın tabanında bulunur.Yedi yan kanal, membran yüzeyinden çıkarak giriş hücresinden hücrenin dışına doğru gider.Şekil, doğal ortamında 268.000 atomlu alfa-hemolizin modelini göstermektedir - bir lipit iki tabakalı.

Uygulama

Alfa-hemolizinin çeşitli özellikleri bu membran kanalını çeşitli biyoteknolojik uygulamalar için uygun hale getirir: monte edilmiş alfa-hemolizin geniş bir pH ve sıcaklık aralığında stabildir, transmembran gözenekleri normal şartlarda açık kalır, alfa-hemolizin çeşitli biyolojik veya sentetiklere bağlanabilir lipit çift tabakaları, bağlanma kendiliğinden ilerler ve spesifik iyonik koşullar gerektirmez.

a. Teslimat sistemleri. Alfa-hemolizinin transmembran gözenekleri, iyonların ve şekerler veya nükleotitler gibi küçük organik bileşiklerin, bir hücrenin plazma membranı boyunca veya sentetik lipit veziküllerinin duvarlarından kontrollü iletimini kolaylaştırabilir.Montaj ve iletkenlik, ışık dahil harici biyokimyasal veya fiziksel uyaranlar tarafından tetiklenebilen veya açılabilen genetik olarak tasarlanmış alfa-hemolizinler kullanılarak, bir lipit iki tabakası, küçük çözünenler için geçirgen hale getirilebilir.

b. Stokastik Sensörler.Bir lipit çift tabakasında asılı kalan, bir alfa-hemolizin kanalı, genetik olarak yeniden tasarlanmış gövdesinin içine moleküler bir adaptör yerleştirildiğinde stokastik bir sensör haline gelir ve uygulanan bir voltaj sapmasının neden olduğu transmembran iyonik akımı etkiler.Analitlerin moleküler adaptöre tersinir bağlanması, iyonik akımı geçici olarak azaltır.Akım azaltımının büyüklüğü analit tipini gösterirken, akım azaltma aralıklarının sıklığı analit konsantrasyonunu yansıtır.Bu tür stokastik sensörlerin, tek bir sensör elemanı ile birkaç organik analitin konsantrasyonlarını ve iki veya daha fazla iki değerlikli metal iyonunun çözelti konsantrasyonlarını aynı anda ölçtüğü gösterilmiştir.İki farklı proteinin konsantrasyonlarını eşzamanlı olarak belirlemek için nanometre boyutunda alfa-hemolizin gözenekleri başka bir tür stokastik sensörde kullanıldı.

c. DNA dizilimi. Alfa-hemolizinin transmembran gözenekleri sadece küçük çözünenleri değil, aynı zamanda oldukça büyük (onlarca kDa) doğrusal makromolekülleri de iletebilir.Böylece, bir zar-ötesi potansiyel tarafından tahrik edilen DNA ya da RNA zincirleri, alfa-hemolizinin gözenekleri boyunca yer değiştirerek tek tek tellerin kimyasal yapısını yansıtan iyonik akım blokajlarını üretebilir.Bu gibi birçok blokaj akımının istatistiksel analizi, araştırmacıların farklı RNA ve DNA homopolimer sekanslarının yanı sıra tek bir RNA molekülü içindeki pürin ve pirimidin nükleotit segmentlerini ayırt etmelerine izin verdi.DNA saç tokaları için tek bir nükleotit çözünürlüğü gösterilmiştir, bu da nükleotit sekansını doğrudan bir DNA veya RNA zincirinden okuyabilen bir nanopore sensörü oluşturma olasılığını arttırır.

Yapıları

Birkaç hemolizin yapısı, çözünür ve gözenek oluşturucu uyumlarda X-ışını kristalografisi ile çözülmüştür.Örneğin, a-hemolizinStaphylococcus aureusbiyolojik zarlarda homo-heptamerik bir P-varili oluşturur.Vibrio cholerae sitolizin ayrıca heptamerik bir gözenek oluşturur. Staphylococcus aureus P-hemolizin oktamerik bir gözenek oluşturur.

Α-hemolizinin heptamerinden Staphylococcus aureusmantar benzeri bir şekle sahiptir ve 100 Å çapında ve 100 Å yüksekliğindedir.Membranlı, çözücüye erişilebilen bir kanal yedi kat ekseni boyunca uzanır ve çapı 14 Å ila 46 Å arasında değişir.14 telli antiparalel β varilin dış tarafında, lipit çift tabakasının polar olmayan kısmına tamamlayıcı bir yüzey sağlayan yaklaşık 30 A genişliğinde bir hidrofobik kemer bulunur.Arayüzler hem tuz bağlantıları hem de hidrojen bağlarından ve hidrofobik etkileşimlerden oluşur ve bu temaslar, 65 ° C'ye kadar SDSsolutions'da heptamer için moleküler bir stabilite sağlar.

Akış şeması

 

 

Not: Sadece Araştırma Kullanımı içindir.Teşhis prosedürlerinde kullanılmaz.